陈江生¹陈保东²凌毕益³宋明浩¹李志祥¹

（1.深圳市宝安区松岗人民医院神经外科，518105

2.深圳市第二人民医院神经外科，518000

3.深圳市宝安区松岗人民医院神经外科，518105）

摘要：目的: 探讨葛根素对创伤性脑损伤(TBI)模型大鼠的神经保护作用及脑组织红系衍生的核因子相关因子2(Nrf2)一抗氧化反应原件(ARE)信号通路参与的机制。方法:选择健康成年雄性大鼠体重250～300g构建TBI模型。将动物分为四组：损伤组（A组），假手术组（B组），葛根素治疗的损伤组（C组），和葛根素治疗的假手术组（D组）。通过采用改良的神经功能缺损评分（mNSS）评价神经功能，脑组织干湿重称量法评价脑水肿，Nissl染色，TUNEL染色评价脑损伤体积和神经元的凋亡。使用酶活试剂盒检测损伤48小时后抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化应激产物MDA和NO的含量。最后使用western blot和RT-PCR的方法检测Nrf2-ARE信号通路及其下游分子HO-1，NQO1的表达改变。结果：TBI手术后mNSS评分明显增高（P<0.05），葛根素治疗组能够明显降低mNSS评分（P<0.05）改善神经功能。TBI手术后脑水肿增加神经元凋亡增加（P<0.05），葛根素治疗组能够明显挽救脑水肿神经元凋亡（P<0.05）。TBI手术后12h后脑内抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性增加氧化应激产物MDA和NO的含量增加（P<0.05），葛根素治疗组能够明显降低抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化应激产物MDA和NO的含量（P<0.05）。western blot和RT-PCR结果表明葛根素不改变Nrf2的翻译和表达，但是RT-PCR结果表明葛根素能够明显促进Nrf2-ARE信号通路下游分子HO-1，NQO1的表达。结论：葛根素通过Nrf2-ARE信号通路抵抗氧化应激对创伤性脑损伤发挥神经保护作用

关键词：葛根素，Nrf2-ARE信号通路，创伤性脑损伤，氧化应激

Puerarin protects traumatic brain injury through Nrf2-ARE pathway to resist oxidative stress

ChenJiangSheng¹ChenBaoDong²LingBiYi³SongMingHao¹LiZhiXiang¹

(Department of Neurosurgery, Songgang people's Hospital, Baoan District, Shenzhen 518105

Department of Neurosurgery, Shenzhen No.2 People's Hospital, 518000

Department of Neurosurgery, Songgang people's Hospital, Baoan District, Shenzhen 518105)

Abstract: objective: To investigate the puerarin protective effect on traumatic brain injury (TBI) model rats through tissue red derivative of nuclear factor related factor 2 (Nrf2) antioxidant/electrophilic response element (ARE) signal pathway. Methods: TBI model was constructed using healthy adult male rats weigh 250～300 g. Animals were divided into four groups: injury group (group A) and control group (group B), puerarin treatment of injury group (group C), and puerarin treatment of control group (group D). Modified neural function defect scale (mNSS) were used to evaluate neural function, brain wet weight evaluation method was used for the weighing cerebral edema, Nissl staining, TUNEL staining was used to evaluate brain damage volume and neuronal apoptosis. Using enzyme activity kits detect the activities of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress productor GSSG and NO at 12 hours after injury. Finally using western blot and rt-pcr methods to detect the expression of Nrf2 - ARE signaling pathway and its downstream molecular HO - 1, NQO1 levels. Results: After TBI surgery, mNSS scores were significantly higher (P < 0.05), puerarin treatment significantly reduced mNSS score (P < 0.05) and improved brain function after TBI. After TBI surgery increased edema and neuronal apoptosis (P < 0.05), puerarin treatment group significantly rescued cerebral edema, neuron apoptosis (P < 0.05). At 48 h after TBI surgery the activity of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress product GSSG and NO were increased (P < 0.05), puerarin treatment significantly reduced the activities of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress product GSSG and NO (P < 0.05). Western blot and RT-PCR results showed that the puerarin did not change the translation and expression of Nrf2, but the RT-PCR results showed that puerarin significantly enhanced the Nrf2 - ARE signaling pathways downstream molecular HO - 1, and NQO1. Conclusion: Puerarin has protective effect on traumatic brain injury through Nrf2 - ARE signaling pathways to resist oxidative stress.

创伤性脑损伤主要包括原发性脑损伤和继发性脑损伤，是威胁45岁以下成年人群致死致残的重要原因给家庭和社会带来严重负担，目前并没有有效的治疗药物^[1]。研究表明氧化应激反应是引起继发性脑损伤的主要病理机制^{[2, 3]}，而Nrf2-ARE信号通路参与调解创伤性脑损伤中的氧化应激反应^[4]。葛根素在多种疾病模型中能够显著的清除氧自由基发挥抗氧化作用^[5]。本研究通过探讨葛根素对创伤性脑损伤的神经保护作用，氧自由基的清楚以及对Nrf2-ARE信号通路的影响，从而为创伤性脑损伤的治疗提供新的干预措施和新的理论基础。

1 材料与方法

1.1试验动物和试剂： 选择成年健康雄性SD大鼠 80只，体质量230～260 g，周龄 7～8周，由史莱克实验动物有限公司购买。主要试剂: Nissl和TUNEL检测试剂盒购自美国罗氏生物公司，蛋白提取试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。GSSG、GSH、 SOD酶活试剂盒 ，MDA和NO检测试剂盒  (南京建成生物工程研究所)批号分别为20080829,20080801,20071129,20080801,20080801; 兔抗Nrf-2单克隆抗体  (Santa Cruz biotechnology公司)。RT-PCR逆转录试剂盒（碧云天生物科技有限公司）和引物合成（上海生工生物科技有限公司）。

1.2 TBI模型建立：本实验的动物模型采BenchmarkTM颅脑损伤撞击器建立TBI模型。具体操作如下：使用2%戊巴比妥（50mg/kg）通过腹腔注射进行麻醉，完全深麻醉后将大鼠固定在外伤模型装备架上。在大鼠头部消毒后在正中切口，暴露颅骨。以Bregma为中心坐标xy轴坐标（-2.5 mm，-2.5 mm）处使用颅骨打磨器钻出直径5mm骨孔作为撞击点。用5mm直径的撞击头，以3m/s的速度撞击选定的颅骨位置，打击深度为2mm，打击时间为120ms。然后取出撞击器把头皮缝合，并放回饲养笼。假手术组同样进行手术操作但不予以重物撞击。在撞击过程中20%～25%的大鼠当即死亡正常苏醒的大鼠无后续的死亡发生。当大鼠苏醒后给与腹腔注射葛根素（60mg/kg）48小时后麻醉大鼠取脑进行后续试验。

1.3神经功能评价： mNSS评分用于神经功能评价，总分最高为18分，最低为3分，其中包括运动对称性、自发运动、攀爬能力、提尾时双前肢对称性、惊吓反应、触须反应等六大方面。根据每个测试项目中大鼠行为能力给与０至３分评分，具体标准参照文献^[6]。

1.4 Nissl和TUNEL染色：按照试剂盒标准步骤进行操作进行Nissl和TUNEL染色。在400倍镜下进行拍照和观察凋亡细胞情况，以细胞核染上棕黄色颗粒表示 TUNEL阳性细胞，Nissl染色的区域面积来计算大脑的完整性面积。

1.5 抗氧化酶活性以及氧化应激产物测定：造模成功后给与葛根素48小时后取出大鼠脑组织。根据酶活试剂盒检测损伤抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化应激产物MDA和NO的含量试剂盒的操作步骤进行检测。结果标准化到假手术组。

1.6 RT-PCR：用 Trizol沉淀法提取总 RNA,按照逆转录试剂盒的操作步骤进行逆转录反应。所得 c DNA用于后续实时荧光定量 PCR反应。同时将GAPDH作为内在参照基因。同时将 PCR产物进行测序以及做熔解曲线,  以保证以上 PCR反应产物良好的特异性。计算△Ct值用来比较给药前后 m RNA的表达变化。每个PCR反应都进行3个复孔。

1.7 Western Blot：将样品使用RIPA进行总蛋白的提取,  Bradford法进行蛋白浓度测定。每孔上样 20μg蛋白,  10%  SDS-PAGE分离样品,  电泳完成后进行常规转膜, 封闭。5% BSA稀释一抗 (兔抗 Nrf-2单克隆抗体), 4 ℃孵育过夜。第二天用TBST进行洗膜,  将膜浸入二抗稀释液（1∶10000）中, 室温孵育2h。TBST进行洗膜后，加入 ECL发光试剂,  暗室进行曝光, 显色, Image J 软件用于数据分析。

1.8统计学方法：SPSS16.0 统计学软件运用于对数据进行分析，计数资料采用 卡方检验及 Fisher 精确概率检验，计量资料使用（x±sd）呈现，并采用两因素方差分析（two way anova）检验。P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 葛根素提高大鼠创伤后神经功能评分

本试验通过创伤后48小时mNSS的评分来评估葛根素对创伤大鼠神经功能的保护作用。结果示创伤后48小时与对照组相比，创伤组有明显的神经功能损伤症状，mNSS的评分下降，而葛根素治疗组显示腹腔注射葛根素后能明显改善大鼠的神经功能，表现为mNSS的评分增加，而单独给与葛根素于假手术组无统计学差异见图1。

图1. 葛根素提高大鼠创伤后mNSS的评分,与对照组相比，创伤组有明显的神经功能损伤症状，mNSS的评分下降，而葛根素治疗组显示腹腔注射葛根素后能明显改善大鼠的神经功能（n=10, *p<0.05 A组与B组比较，#p<0.05 C组与A组比较）。

2.2 葛根素改善TBI大鼠神经元损伤

细胞凋亡能够反映神经元变性，本实验通过Nissl和TUNEL染色观察神经元变性的面积和比例。结果表明创伤后48小时与对照组相比，创伤组有明显的神经元变性，Nissl和TUNEL染色观察神经元变性的面积和比例增加，而葛根素治疗组显示腹腔注射葛根素后能明显降低神经元变性的面积和比例，而单独给与葛根素于假手术组无统计学差异见表2。

表1. Nissl和TUNEL染色观察神经元变性的面积和比例

*p<0.05 A组与B组比较，#p<0.05 C组与A组比较

2.3 葛根素增加抗氧化酶活性并降低氧化应激产物水平

氧化应激是二次损伤的核也病理环节。我们检测抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化应激产物MDA和NO的含量，结果表明创伤后48小时与对照组相比，创伤组有明显抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性的增高，但是氧化应激产物MDA和NO的含量也同时增高，而葛根素治疗组显示腹腔注射葛根素后能明显进一步增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性，同时明显的降低氧化应激产物MDA和NO的含量，而单独给与葛根素于假手术组无统计学差异见表2。

表2. 创伤后抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化应激产物MDA和NO的含量

*p<0.05 A组与B组比较，#p<0.05 C组与A组比较

2.4 葛根素激活Nrf2-ARE信号通路下游分子

Western blot和RT-PCR结果表明葛根素不改变Nrf2的翻译和表达，但是RT-PCR结果表明葛根素能够明显促进Nrf2-ARE信号通路下游分子HO-1，NQO1的表达见表3。

表3. 葛根素能够明显促进Nrf2-ARE信号通路下游分子HO-1，NQO1的表达。

*p<0.05 A组与B组比较，#p<0.05 C组与A组比较。

3. 讨论

创伤性脑损伤主要包括原发性脑损伤和继发性脑损伤，是威胁45岁以下成年人群致死致残的重要原因给家庭和社会带来严重负担，目前并没有有效的治疗药物^[1]。继发性脑损伤是指原发性损伤后的胶质细胞过度活化，炎症应激反应，氧化应激等复杂反应的综合反应，继发性脑损伤是创伤性脑损伤后慢性神经变性及神经功能损伤的主要机制。目前认为氧化应激是继发性脑损伤的核心的病理环节，研究表明氧化应激反应是引起继发性脑损伤的主要病理机制^{[2, 3]}。研究表明氧化应激主要通过细胞膜脂质过氧化产生丙二醛(MDA)对血管内皮造成损伤 ，其中损伤机制是通过增加细胞内Ca2 +浓度，降低NO的分泌，导致血管收缩功能受损^[7]。MDA， NO的含量可反映氧化应激下组织受损程度^[8]，本实验发现腹腔注射葛根素后能明显的降低氧化应激产物MDA和NO的含量，降低神经元变性的面积和比例，改善大鼠的神经功能。机体具有自主清除过量氧化应激产物并抵抗过度氧化系统，包括SOD， GSH，和GSSG等多种抗氧化酶，这些抗氧化酶在机体受到氧化应激损伤时起到重要的防御作用但这种作用的维持是有限的，当受到过度损伤时机体的抗氧化体系并不能完全清除伤害^{[9, 10]}。本实验结果显示创伤后48小时与对照组相比，创伤组有明显抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性的增高，但是氧化应激产物MDA和NO的含量也同时增高，而葛根素治疗组显示腹腔注射葛根素后能明显进一步增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性，同时明显的降低氧化应激产物MDA和NO的含量，因此葛根素是通过增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性来清除氧化应激产物。

大量研究表明Nrf2-ARE信号通路参与调解创伤性脑损伤中的氧化应激反应^[4]。葛根素是否通过调节Nrf2-ARE信号通路参与创伤性脑损伤抗氧化应激过程。我们发现葛根素不改变Nrf2的翻译和表达，但是RT-PCR结果表明葛根素能够明显促进Nrf2-ARE信号通路下游分子HO-1，NQO1的表达。Nrf2是机体降低活性氧,  抵御氧化应激的重要转录因子^[11]。正常情况下, Nrf2在胞浆中与抑制因子Keap1结合, 处于失活性状态。在诱导 Nrf2激活后,  Nrf2与 Keap1分离,  转入细胞核中,  进而识别并结合抗氧化反应元件  (ARE),  启动下游基因表达,增强细胞抗损伤能力,  从而有效防御有害物质的攻击^[4]。Nrf2调控下游主要基因分别为为解毒酶基因和抗氧化基因，应激基因等。其中醌 氧 化 还 原 酶 1［NAD (P) H: quinoneoxidoreductase-1， NQO1和血红素加氧酶-1 (hemeoxygenase-1， HO-1)发挥对抗氧化应激作用。以往研究表明 HO-1在脑外伤后表达下降并能够预测脑梗死后神经变性的预后情况^{[12, 13]}。NQO1同时也是Nrf2下游调控表达的细胞保护性蛋白，在多种退行性疾病中起到重要作用^[14]。葛根素在多种疾病模型中能够显著的清除氧自由基发挥抗氧化作用^[5]。本研究通过探讨葛根素对创伤性脑损伤的神经保护作用，氧自由基的清楚以及对Nrf2-ARE信号通路的影响，发现葛根素可能通过激活 Nrf2入核进而激活下游解毒酶和抗氧化靶基因酶的表达、清除MDA和NO,  提高细胞加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性,  减轻创伤性脑损伤的神经功能损伤，从而为创伤性脑损伤的治疗提供新的干预措施和新的理论基础。

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[13] 吴丹. HO-1调控Nrf2-ARE信号通路对脑出血后神经保护作用的实验研究[D]. 南昌大学,2014.

[14] 王伟. Nrf2-ARE信号通路在癫痫脑损伤中的作用及莱菔硫烷的神经保护机制研究[D]. 河北医科大学,2014.

基金项目编号：2015年深圳市科技计划项目JCYJ20150403115305748

课题名称：抗氧化剂葛根素对创伤性脑损伤的神经保护作用和机制的研究