张季1  李杨2  李析胤2  杨思源2  易子寒2

作者单位：1云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）乳腺外一科650118

          2云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）内一科

【摘要】目的 研究HIF-1α、TP、VEGF在乳腺癌中的表达及其与癌组织生长、浸润及转移的关系。方法 选取2016年6月-2017年10月在本院进行手术治疗的86例乳腺癌患者，采用免疫组化法对86例手术切除的乳腺癌患者的肿瘤组织和20例正常的乳腺组织进行HIF-1α、TP、VEGF水平的检测，分析它们在不同组织中的表达水平，以及与癌组织浸润深度、淋巴结转移情况的相关性。结果：HIF-1α在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的阳性表达率分别为59.3%和5.0%，TP在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的阳性表达率分别为46.5%和0%， VEGF在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的阳性表达率分别为48.8%和10%，差异均具有统计学意义（P<0.05）。另外，HIF-1α、TP、VEGF在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达与分化程度密切相关，在低分化的患者中，三者的阳性表达显著高于高、中分化的患者（P<0.05）；在TMN分期的Ш期患者中，三者的阳性表达显著高于Ⅰ期、Ⅱ期的患者（P<0.05）；三者在淋巴结转移的患者组织中的阳性表达显著高于无转移的患者（P<0.05）；并且在肿瘤组织浸润深度为T3+T4的患者中，三者的阳性表达显著高于Tis+T1和T2的患者（P<0.05）。结论：乳腺癌组织中HIF-1α、TP、VEGF均呈阳性表达，并且三者与乳腺癌组织的发生、浸润和转移密切相关。

【关键词】HIF-1α；TP；VEGF；乳腺癌；生长；浸润；转移

The expression of HIF-1α, TP and VEGF and it’s relationship of growth, infiltrating and metastasis in breast cancer patients

【Abstract】 Objective To study the expression of HIF-1α, TP and VEGF and it’s relationship of growth, infiltrating and metastasis in breast cancer patients. Methods 86 patients were randomly selected from June 2016 to Oct 2017. HIF-1α, TP and VEGF level were detected using immunohistochemical method in tumor and normal tissue, and to analysis the relationship with the growth, infiltrating and metastasis in breast cancer patients. Results The expression rates of HIF-1α in tumor and normal tissue were respectively 59.3% and 5.0%, the expression rates of TP in tumor and normal tissue were respectively 46.5% and 0%, and VEGF were 48.8% and 10% (P<0.05). Positive expression of HIF-1α, TP, VEGF had close relationship with tumor differentiation, which were higher in well differentiated than lowed differentiated (P<0.05). Positive expression of HIF-1α, TP, VEGF had close relationship with staging, which were higher in stage  Ш than stage Ⅰand Ⅱ (P<0.05) . Positive expression of HIF-1α, TP, VEGF also had close relationship with lymphatic metastasis, as well as infiltration depth, which were higher in T3+T4 than others (P<0.05). Conclusions By immunohistochemical method, the expression of HIF-1α, TP, VEGF in tumor tissue were all positive and all had relationship with growth, infiltrating and metastasis in breast cancer patients.

【Key words】HIF-1α; TP; VEGF; Growth; Infiltrating; Metastasis; Breast cancer

乳腺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，也是全世界范围内妇女的多发性肿瘤，发病率在近几年内呈持续上升趋势，严重影响了人类的生活和健康，其具体病因目前仍未研究清楚^[1-3]。有研究表明，在过去几十年，乳腺癌在全世界内的发病率几乎翻番，因此对于乳腺癌的预防、控制及有效治疗问题亟待解决^[4,5]。随着基因分子诊断技术的发展，越来越多的研究发现缺氧诱导因子-1（HIF-1α）、胸苷磷酸化酶（TP）、血管内皮生长因子（VEGF）等关键因子与肿瘤的发生发展有密切关系^[6,7]。研究表明，缺氧诱导因子-1（HIF-1α）、胸苷磷酸化酶（TP）、血管内皮生长因子（VEGF）是促进肿瘤细胞增殖及血管生成非常关键的因子，与肿瘤组织的发生、发展、浸润以及转移等过程具有十分密切的关系^[8]。本研究通过免疫组化的方法，分析HIF-1α、TP、VEGF在乳腺癌肿瘤组织中的表达情况，以及与肿瘤组织生长、浸润及转移等的关系，并结合临床病理相关指标，为乳腺癌的诊断及治疗提供科学的参考依据，现报道如下。

1资料和方法

1.1一般资料

选取2016年6月-2017年10月在本院进行手术治疗的86例乳腺癌患者，所有患者均经过病理切片检查确诊为乳腺癌患者，且手术前均没有接受过化疗、放疗等相关针对肿瘤的治疗。患者年龄28-70（平均55.31±7.36）岁，≤55岁31例，>55岁55例；根据病理类型，其中浸润性导管乳腺癌50例，其他类型36例；根据临床分期，Ⅰ期患者22例，Ⅱ期患者40例，Ш期患者24例；根据淋巴结转移情况，其中无转移的患者30例，有转移的患者56例；根据分化程度，其中低分化患者30例，中分化患者40例，高分化患者16例；另外，选取20例正常的癌旁乳腺组织作为对照，癌旁正常组织距离癌组织的边缘3cm以外，来自于手术残端。所有组织均用10%新鲜配制的甲醛溶液固定，并用石蜡进行包埋。本试验经本院伦理委员会批复。

1.2免疫组化实验方法-

将86例乳腺癌患者的肿瘤组织以及正常组织标本作为研究材料（以上组织均为手术切除组织），所有新鲜标本离体后制作为石蜡标本，每个组织蜡块取4µm厚连续切片，经脱蜡、H₂O₂（过氧化氢）进行封闭，之后采用高压锅对样本热修复，滴加一抗，一抗（1:100稀释，购自南京百世金生物技术有限公司，AH337，RCR-0279R，AQP3，0.2mL）37℃孵育1h后滴加二抗试剂（1:500稀释，购自南京金斯瑞生物科技有限公司，A01854-200，0.2mL），37℃孵育30min，用DAB显色液（购自南京奥青生物技术有限公司，DA1010 ）进行显色，按照DAB显色液说明书将A液和B液按照一定比例混合，对二抗孵育后的样本进行显色，最后用苏木素进行复染，封片。其中，每个组织的石蜡切片用HIF-1α、TP、VEGF抗体染色各一张。阴性对照为PBS缓冲液代替一抗染色。

1.3结果判定方法

在高倍显微镜下观察染色结果，HIF-1α、TP、VEGF三者均以细胞质或者细胞膜中呈现棕黄色或者深棕色的颗粒，作为判定为阳性细胞的标准。同时，根据着色颜色和着色细胞数计算阳性，每张切片随机选择8个视野，对阳性细胞的染色强度进行打分，并计算阳性细胞的百分比。其中染色强度打分方法（SI）为：不着色计0分，浅黄色1分，深棕黄色2分，棕褐色计为3分；阳性细胞占全部肿瘤细胞百分比的计算方法（PP）为：无阳性细胞（0%）计0分，阳性细胞1-10%为1分，11%-50%计2分，51-80%计3分，80%以上计4分；最后计算免疫反应积分（IRS）：IRS=PP×SI，即两项评分相乘，若IRS大于3分则为阳性。

1.4统计学分析

应用SPSS19. 0软件对实验结果进行分析。计量资料以（）表示，三组间比较采用方差分析，两组间比较用t检验或X²检验，其中P<0.05为统计学有显著差异。

2结果

2.1 HIF-1α在正常乳腺组织和乳腺癌肿瘤组织中的表达情况

如表1所示，乳腺癌患者的肿瘤组织中HIF-1α的阳性表达患者为51例，阳性表达率为59.3%，正常组织的阳性表达率为5.0%，两组具有显著差异（P<0.05）。

表1 HIF-1α在正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织中的表达情况

2.2 TP在正常乳腺组织和乳腺癌肿瘤组织中的表达情况

如表2所示，乳腺癌患者的肿瘤组织中TP的阳性表达患者为40例，阳性表达率为46.5%，正常组织的阳性表达率为0%，两组具有显著差异（P<0.05）。

表2 TP在正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织中的表达情况

2.3 VEGF在正常乳腺组织和乳腺癌肿瘤组织中的表达情况

如表3所示，乳腺癌患者的肿瘤组织中VEGF的阳性表达患者为42例，阳性表达率为48.8%，正常组织的阳性表达率为10.0%，两组具有显著差异（P<0.05）。

表3 VEGF在正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织中的表达情况

2.4 HIF-1α、TP、VEGF的表达与临床病理特征的关系

HIF-1α、TP、VEGF的表达情况与临床病理特征（年龄，分化程度，肿瘤类型，分期、浸润深度、淋巴结转移情况等）的关系如表4所示。HIF-1α、TP、VEGF在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达与分化程度密切相关，在低分化的患者中，三者的阳性表达显著高于高、中分化的患者（P<0.05）；在TMN分期的3期患者中，3期的阳性表达显著高于1期、2期的患者（P<0.05）；三者在淋巴结转移的患者组织中的阳性表达显著高于无转移的患者（P<0.05）；并且在肿瘤组织浸润深度为T3+T4的患者中，三者的阳性表达显著高于Tis+T1和T2的患者（P<0.05）。

表4 HIF-1α、TP、VEGF的表达与临床病理特征的关系

3结论

乳腺癌是一种血管依赖性恶性肿瘤，有研究表明，有十几种促血管新生因子在乳腺癌患者组织中对血管新生活性表型的转化扮演着重要的角色^[9]。缺氧也是实体瘤微环境的基本特征之一，细胞对缺氧微环境的适应也是肿瘤发展的关键因素^[10]。随着越来越多研究者对肿瘤发生、转移机制的深入探索，发现一些基因水平、分子水平的调节机制不仅是维持肿瘤生长的重要因素，也是促进肿瘤侵袭、浸润甚至转移的关键条件^[11]。

       HIF-1α是组成HIF-1（一种异源二聚体转录因子）的亚单位之一，是专一受氧调节的一个亚单位，直接决定了HIF-1活性及功能^[12]。作为至今发现的唯一能在特异性缺氧条件下起到活性调节作用的转录因子，其在很多基因的转录过程中发挥重要作用^[13]。有研究发现，HIF-1α在肿瘤细胞的生长代谢、浸润、转移以及血管生成等过程中扮演着重要的角色，可以增强肿瘤细胞在缺氧条件下的存活能力，并促进肿瘤组织的血管生成及肿瘤细胞转移^[14]。研究表明，HIF-1α在大多数肿瘤组织中是过表达的，而在正常组织中表达量则很低甚至不表达，而且在转移性乳腺癌患者中的表达率显著高于未转移患者，说明HIF-1α是乳腺癌浸润、转移的生物标志之一，可以作为乳腺癌发生发展过程的临床指标^[15]。

       TP在人体内是广泛分布的，与诱导血管生成以及对抗细胞凋亡等功能有密切关系，而且对于不同组织类型，其表达水平具有很大差异^[16]。一般认为，在肿瘤组织中，尤其是一些实体瘤（如乳腺癌，结直肠癌，肺癌等）TP表达量显著高于正常组织^[17]。研究认为，癌细胞代谢活跃，核酸合成旺盛，因此TP活性一般高于正常细胞^[18]。近几年研究表明，肿瘤组织中的TP在基因以及蛋白水平的表达均高于正常组织，通常达到正常组织的3-10倍，与肿瘤类型及其对应的核苷酸代谢酶密切相关^[19]。

       VEGF是一种具有肝素亲和作用的胞外分泌二聚体糖蛋白，是重要的血管生成刺激因子，并且在血管通透性中发挥着重要作用，对血管内皮细胞的生长、增殖等有重要的调控作用^[20]。VEGF的正常表达是保证机体细胞处于正常生理状态的重要因素，如果其表达失控，会引起很多肿瘤的发生、转移等^[21]。有研究表明，VEGF是刺激肿瘤血管生成的最关键因子之一，一般是通过旁分泌的方式与特异性受体结合，从而影响内皮细胞的增殖、迁移等^[22]。VEGF还可以诱导血管的生成，而对于肿瘤组织来说，丰富的新生血管与实体瘤的浸润、转移等密切相关，VEGF增加了肿瘤细胞进入血液循环的概率，并增加了肿瘤细胞入侵邻近淋巴管的机会，促进了肿瘤组织的浸润、转移，并影响肿瘤患者的预后^[23]。

乳腺癌的发生、发展、浸润以及转移等过程中有很多基因都参与了表达，本研究通过检测分析乳腺癌患者肿瘤组织中HIF-1α、TP、VEGF的表达水平与正常组织的差异，以及三者与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移等的关系，在一定程度上证实了HIF-1α、TP、VEGF对于乳腺癌组织的发生、发展是有预测价值的。因此，HIF-1α、TP、VEGF在患者预后以及临床治疗方案的选择中具有重要的意义，值得临床推广和应用。

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