山西省人民医院 消化科，吕俊旭，邮编030012，

摘要 目的：研究Ghrelin对大鼠乙醇诱导的急性胃粘膜损伤的保护作用和可能机理。方法：75%乙醇灌胃制作急性胃粘膜损伤模型。乙醇灌胃前1小时分别腹腔内注射生理盐水、0.5μg Ghrelin、5μg Ghrelin。乙醇灌胃1小时后处死动物，组织学观察炎症程度并计算胃溃疡指数。RT-PCR测定胃粘膜组织中环氧化酶-1和环氧化酶-2 mRNA的表达。结果：Ghrelin组的大鼠胃粘膜损伤及炎症反应明显小于生理盐水组，Ghrelin组的溃疡指数明显小于生理盐水组，并呈剂量依赖性。Ghrelin组的COX-1的mRNA表达与生理盐水组无统计学差别，但Ghrelin组的COX-2的mRNA表达较生理盐水组明显减少。结论：Ghrelin对乙醇诱导的大鼠急性胃粘膜损伤有明显保护作用，对炎症反应有抑制作用，其机制可能是通过抑制COX-2的过度表达而起作用。

关键词 Ghrelin；环氧化酶系统；胃粘膜损伤

Ghrelin 是由日本科学家Kojima 发现的一种新的脑肠肽1,是迄今发现的唯一生长激素释放激素受体( GHSR) 的天然配体。Ghrelin 是由28 个氨基酸残基组成 2,主要来源于胃黏膜X/ A 样细胞3,在胃切除手术后，血浆ghrelin水平明显下降4。Ghrelin作用受体主要分二类，一是生长激素促分泌受体1a（GHSR-1a）主要分布在下丘脑、腺垂体,有很强的促生长激素释放作用；另一种是GHSR-1b，广泛分布在胃肠道，但目前功能还不清楚。

研究发现Ghrelin不仅具有增加食欲，促进胃动力作用５，同时也是一种胃粘膜的保护因子。在Sibilia的大鼠胃粘膜损伤的实验中显示外源性的Ghrelin 对胃粘膜有着保护作用６。胃粘膜保护是一系列复杂的反应的结果，有多因素参与，其中最重要之一就是环氧化物酶（cyclooxygenase,COX）系统。COX是催化花生四烯酸氧化反应产生前列腺素（prostaglandins，PGs)的限速酶，对维持胃粘膜完整性，增加胃粘膜血流都具有重要保护作用7。

在Ghrelin产生胃粘膜保护作用中，目前我们对COXs发生的变化情况了解甚少。因此探讨Ghrelin与COX-1、COX-2表达水平变化，对研究Ghrelin在胃粘膜保护和炎症反应中的作用机制有重要意义。本实验的目的是观察和验证Ghrelin对胃粘膜的保护作用，检测COX系统的表达变化来初步探讨Ghrelin的胃粘膜保护的作用机制。

材料和方法

一、实验动物和试剂　

健康SD大鼠64只（上海西普尔-必凯实验动物公司），体重400-500g，雌雄各半。Ghrelin(GenScript公司)按5μg/ml配成200ml，PCR试剂盒(Invitrogen公司)，75%乙醇（上海利康消毒公司），PCR扩增仪（ABI公司）

二、大鼠急性胃粘膜损伤模型建立和分组　

大鼠雌雄各半，随机分4组，每组16只：（1）正常空白组；（2）75%乙醇+生理盐水对照组（生理盐水组）；（3）75%乙醇+0.5μg Ghrelin干预组（0.5μgGhrelin组）；（4）75%乙醇+5μg Ghrelin干预组（5μgGhrelin组）。实验前大鼠禁食24小时，自由饮水。空白对照组仅腹腔内注射生理盐水，其余三组皆腹腔内给生理盐水或Ghrelin 1小时后，每只大鼠均予以75%乙醇按1ml/100g剂量给大鼠灌胃，1小时后麻醉取胃。

三、大体标本观察 观察各组大鼠胃大体标本变化。

四、胃粘膜损伤指数

各组中随机选出8只大鼠，雌雄各半。处死取出胃，并向胃内注入10％甲醛4ｍＬ，置于同浓度甲醛中充分固定。30min后，沿胃大弯剪开胃，展平并置于10X解剖显微镜下观察胃出血性病灶，并用测微尺计算胃粘膜损伤面积计算胃粘膜损伤指数。按文献参考标准8：正常胃黏膜为0分，点状损伤计1分，病损小于1mm计2分，1～2mm计3分，2～3mm计4分，依次类推，损伤宽度大于2mm，损伤指数计分加倍,总和计全胃溃疡指数。

五、组织学观察

于上述8只大鼠胃窦部取材，石蜡切片，HE染色，光镜下观察粘膜损伤程度及炎症细胞浸润程度。

六、荧光半定量PCR法测胃COX-1和COX-2　

根据Genbank数据库中公开发表的基因序列，设计合成COX-1引物序列（上海生工），上游5′　-TTTGCACAACACTTCACCCACCAG-3′；下游：　5′-AAACACCTCCTGGCCCACAGCCAT-3′，产物片段568bp。COX-2引物序列，上游：5′-GTTGAAAGCCCTCTACCATGACA-3′；下游：5′-TTGAGGCAGTGTTGATGATCCT-3′ ，产物片段521bp。β-actin引物序列，上游为5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG -3′,下游序列为：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，PCR产物长828hp。标本采用Trizol提取胃窦粘膜组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA，以β-actin为内参照同时进行PCR检测。反应条件为94℃ 60s、63℃ 45s、72℃ 60s，30个循环。合酶链反应产物用溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶电泳分析，分别对COX-1和COX-2进行吸光度扫描，图像分析仪计算出COX-1和COX-2的基因表达量与β-actin基因表达量的比值。

七、统计学处理　　

所有资料经SPSS13.0统计软件处理。数据以均数±标准差表示，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、大体标本观察

生理盐水组大鼠胃粘膜基本完全重度出血坏死，色泽发黑，粘膜脱落，组织松脆，触之易出血；0.5μgGhrelin组大鼠胃粘膜大部有明显糜烂出血，部分坏死，触之易出血；5μgGhrelin组大鼠胃粘膜见部分斑片状糜烂出血，粘膜基本完整（图1）。

图1 胃粘膜大体标本

空白组                生理盐水组

0.5μgGhrelin组       5μgGhrelin组

二、胃粘膜损伤指数评价

大鼠各Ghrelin组的溃疡指数明显要小于NS组，并且呈剂量依赖性（图２）。

图2 胃溃疡指数

注：与NS组相比 **P<0.01，差异有统计学意义

三、组织学观察

空白组粘膜结构正常，生理盐水组黏膜结构排列紊乱失去完整性及连续性，部分区域黏膜上皮层缺失，损伤多累及胃深部腺体，可见大量中性粒细胞、单核细胞、浆细胞。0.5μgGhrelin组粘膜各层排列欠整齐，损伤累及胃小凹及胃腺体，可多见中性粒细胞、单核细胞。5μgGhrelin组粘膜结构排列大部完整，部分胃腺体破坏，炎性细胞少见（图3）。

图3 组织学HE染色×100

空白组                生理盐水组

0.5μgGhrelin组       5μgGhrelin组

四、荧光半定量PCR法测胃COX-1和COX-2表达量变化（图4）

图4 COX-1和COX-2的mRNA表达

            空白组  NS组   0.5μgGH组 5μgGH组        

注：与NS组比较，P>0.05,差异无统计学意义

                          空白组  NS组 0.5μgGH组 5μgGH组

注：与NS组比较，*P<0.05,**P<0.01，差异有统计学意义

讨论

高浓度乙醇对胃粘膜损伤机制是多方面的，有脱水、蛋白凝固、溶解等作用，还能引起中性粒细胞浸润，刺激炎症因子。在实验中我们观察到各组大鼠胃粘膜损伤程度有着显著差异。在大体胃粘膜观察中生理盐水组大鼠胃粘膜严重坏死，为高浓度乙醇所致急性胃粘膜损伤。0.5μgGhrelin组大鼠胃粘膜损伤程度要明显轻于生理盐水组，部分粘膜有坏死。5μgGhrelin组大鼠胃粘膜仅见斑片状糜烂出血，粘膜基本完整。在胃粘膜损伤指数评估中，0.5μgGhrelin组和5μgGhrelin组的大鼠胃粘膜损伤指数要明显低于生理盐水组，有统计学差异。组织学观察中也发现Ghrelin组的胃粘膜结构排列较整齐，胃小凹和胃腺体损伤少，出血较生理盐水组明显减轻，炎性细胞浸润也较生理盐水组减少。表明外周予以Ghrelin能明显减轻乙醇诱导的急性胃粘膜损伤，能保护胃粘膜结构完整性，减少出血，具有较强的胃粘膜保护作用，同时可以减少炎性反应，并且这种保护作用呈剂量依赖相关性。

前列腺素是保护和修复胃粘膜完整性的重要因子，也是重要的炎症因子。环氧化酶是催化前列腺素的限速酶，分为2个亚型：COX-1和COX-2。其中COX-1在大多组织中的表达比较稳定，属于“结构酶”，表达生理性前列腺素，维持胃肠道，肾脏的血流稳定，对胃粘膜起到保护和修复作用。COX-2在胃肠道一般为诱导酶，其产物前列腺素及血栓素A2(thromboxan A2，TXA2)。与炎症反应有关9。通过荧光半定量PCR检测，发现在实验所有各组大鼠胃粘膜COX-1的mRNA表达基本稳定，无明显统计学差异，表明COX-1的表达不受乙醇和Ghrelin的影响。在COX-2的mRNA测定中，空白组COX-2表达为低水平，生理盐水组极高水平表达，表明正常组织中COX-2低水平表达，在受到乙醇刺激后，COX-2可以过度表达，产生大量前列腺素，血栓素A2导致水肿，炎性细胞聚集组织破坏。而Ghrelin组大鼠胃粘膜COX-2的mRNA表达都较生理盐水组大鼠明显降低，统计学差异显著。并且其降低程度与Ghrelin剂量的增加相关，表明Ghrelin与COX-2的表达变化之间有一定的联系，并有剂量相关性。同时此两组胃粘膜损伤明显减轻，COX-2 mRNA表达也明显减少，表明在Ghrelin作用下胃粘膜组织中COX-2的过度表达受到抑制，减轻了炎症的发展，保护了胃粘膜。

本实验验证了Ghrelin具有强大的胃粘膜保护和抑制炎症反应的作用，其效果是显著并且迅速的。试验中大鼠给予Ghrelin后使得 COX-2的表达下降，同时胃粘膜的损伤程度减轻。说明Ghrelin的胃粘膜保护机制中，抑制了COX-2的过度表达减少了炎症损伤。而给予Ghrelin后COX-1 mRNA的表达并未发生显著改变，说明Ghrelin对COX-1并不产生作用，其对粘膜完整性的保护可能有其他途径。

各种理化、药物、应激而导致的急性胃粘膜出血是上消化道出血的常见原因，。Ghrelin胃粘膜保护作用的这一发现，可能会成为治疗急性胃粘膜损伤的一种有效方法，值得我们进一步深入研究。

参考文献

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3.    Hosoda H，Kojima M，Mizushima T，et a1．Structural　divergence of human ghrelin：Identification of multiple ghrelin－derived molecules produced by post－translational processing．[J]Biol Chem，2003,278(1)：64—70

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