刘梅，黄翔鹄，李长玲，钱欣，黎家润

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524025）

摘要：在实验室条件下模拟多种氮源共存的虾池水环境，利用稳定同位素示踪剂，研究了温度、光照、盐度、pH、藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响。结果表明：温度、光照和藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率影响极显著（P<0.01）。当温度为20℃，光照为250mmol·m^-2·s^-1，藻浓度为5.5×10⁵cells/ml，波吉卵囊藻对氨氮均有最大的吸收率，分别为：1.114μgN·g^-1·h^-1，1.400μgN·g^-1·h^-1，1.482μgN·g^-1·h^-1。单因素方差分析得出波吉卵囊藻吸收氨氮的最优组合为：温度20℃，光照250mmol·m^-2·s^-1，盐度15，pH 8.5，藻浓度5.5×10⁵cells/ml。因此，可以通过对环境因子的调控，提高波吉卵囊藻对水体中氨氮的吸收率，改善虾池养殖环境，促进健康养殖。

关键词：波吉卵囊藻；氨氮；¹⁵N示踪剂；吸收率

Study on the uptake rate of ammonium by Oocystis borgei under different conditions

LIU Mei，HUANG Xiang-hu，LI Chang-ling，QIAN Xin，Li Jia-run

（Fisheries College, Guangdong Ocean Uniersity, Zhanjiang Guangdong 524025, China）

Abstract: The effect of temperature, light intensity, salinity, pH and algal concentration on uptake rate of ammonium by Oocystis borgei was studied through adding stable isotope tracer in the simulated condition. The resoult showed that temperature, light intensity and algal concentration had a significant influence on the uptake rate of ammonium by Oocystis borgei. The uptake rate got to the maximum when temperature was 20℃, light intensity was 250mmol·m^-2·s^-1 and algal concentration was 5.5×10⁵cell/ml, the values were 1.114μgN·g^-1·h^-1, 1.400μgN·g^-1·h^-1 and 1.482μgN·g^-1·h^-1 respectively. The optimal combination of uptake rate was that temperature was 20℃, light intensity was 250mmol·m^-2·s^-1, salinity was 15, pH was 8.5 and algal concentration was 5.5×10⁵cell/ml by oneway analysis of wariance. Therefore, we can improve the uptake rate of ammonium by Oocystis borgei through controlling the environment factors of prawn pool to promote water quality of shrimp culture.

Keywords: Oocystis borgei; ammonium; stable isotope tracer; uptake rate

在养殖过程中，由于养殖系统中生物群落结构不合理，微藻种群的消亡或微藻群落结构的频繁变化，导致生态系统失衡，物质转化和能量传递效率低，NH⁺₄-N和NO₂^－-N的积累对对虾产生毒害，是对虾发病的主要原因之一^[1,2]。微藻是对虾养殖系统主要的生物因子，其群落结构对维持养殖系统的生态平衡、加速物质循环、提供溶解氧和净化养殖环境具极为重要的作用。通过微藻群落结构的优化，增强对氮的转化效率，改善养殖水环境，是对虾健康养殖的重要技术措施^[3]。

波吉卵囊藻Oocystis borgei隶属于绿藻门Chlorophyta，绿藻纲Chlorophyceae，绿球藻目Chlorococcales，卵囊藻科Oocystaceae，卵囊藻属Oocystis，主要分布于有机质丰富的小水体、半碱水的河口水域和对虾养殖池塘，在集约化对养殖虾池塘中具有种群稳定和适应能力强的特点^[3]。以波吉卵囊藻构建良性的微藻群落，能改善养殖环境水质，增强对虾抗病力^[4]，抑制弧菌的生长^[5]。目前关于利用¹⁵N示踪技术研究浮游植物对水体中氮的累积规律已有不少报道^[6,7,8]。但是利用¹⁵N示踪剂研究微藻对氮源的吸收率的文献还未见报道。本文在实验室条件下，模拟多种氮源共存的虾池水环境，以 ¹⁵N示踪剂，研究不同温度、光照、盐度、pH和藻浓度下波吉卵囊藻对氨氮的吸收率，从而为虾塘水质的生物控制技术的研究提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验藻

波吉卵囊藻（Oocystis borgei），来源于广东海洋大学水产学院藻类研究室。实验时取指数生长期的藻，经4500r/min离心10min—人工海水洗涤—4500r/min离心10min，取藻体备用。

1.1.2实验海水

取自湛江东风码头，用200目纱绢过滤，煮沸灭菌，冷却至室温备用。

1.1.3稳定同位素示踪剂

¹⁵N-NH₄Cl，丰度为98%。

1.2方法

1.2.1正交实验设计

经多次单因子实验，选定温度、光照、盐度、pH、藻浓度为考察因素，以波吉卵囊藻对氨氮的吸收率作为实验结果，按照L₂₅( 5⁵)正交表进行正交实验设计。

表1正交实验因素水平

Table１Factor and level of orthogonal experiments

1.2.2实验方法：

实验用1000ml三角瓶，实验体积为100ml，每组设三个平行组，实验用灭菌海水中4种氮源比例为N-NH₄Cl：N-NaNO₃：N-NaNO₂：N-CO(NH₂)₂=0.8mg/L：0.8mg/L：0.1mg/L：1.5mg/L并按照10% N-NH₄Cl添加¹⁵N-NH₄Cl，在光照培养箱中培养，定时摇动藻液。实验时间为4h。藻液用经450℃烘烤4h并已称重的WhatmanGF/C 47mm滤膜抽滤，将含有藻体的滤膜放入60℃烘箱烘干24h，称取1mg藻体，并用Pressed Tin Capsules 5×9mm锡囊包装，AEI MS 20同位素质谱仪测定藻体中Delta¹⁵N和藻体中的N%含量。

1.3数据处理

根据公式：

Delta ¹⁵N( ‰)=(R_sample / R_standard)×1000^[9]                                       (1)

其中 R_sample为样品¹⁵N／¹⁴N丰度比；R_standard为国际原子能机构(IAEA)确定的标准物质大气氮中的¹⁵N／¹⁴N丰度比，为0.00365。由(1)式计算出¹⁵N／¹⁴N比值即¹⁵N_s。

绝对吸收速率公式Dugdale和Wilkerson^[10]：

                               (2)

其中¹⁵ N_s 为培养后藻样的¹⁵ N 丰度；¹⁵ N_n 为藻样¹⁵ N 的天然丰度；¹⁵ N_enr为加入示踪剂后培养介质初始的¹⁵ N丰度；T 为培养时间h；PON 为微藻所含的总氮含量（μg·g^-1），V的单位为μgN·g^-1·h^-1

2实验结果

2.1 温度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

温度对波吉卵囊藻氨吸收率的影响极显著（P<0.01）（图1，表2），当温度为20℃，氮吸收率达到最大值为1.114μgN·g^-1·h^-1，当温度高于20℃，随着温度的升高藻对氨氮的吸收率逐渐降低。Duncan多重比较表明，当温度为20～30℃，波吉卵囊藻对氨氮均有较大的吸收率。

图1 不同温度下波吉卵囊藻对氨氮的平均吸收率

Fig 1 Uptake rate of ammonia nitrogen by Oocystis borgei at different temperature

注：柱形图中具有相同字母者表示在0. 01水平上差异不显著，否则为差异显著。

2.2 光照对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

光照对波吉卵囊藻氨氮的吸收率影响极显著（P<0.01）（图2，表3），随着光照强度的增加，藻对氨氮的吸收率也随之增加，当光照达到250mmol·m^-2·s^-1时，藻对氨氮有最大的吸收率为1.400μgN·g^-1·h^-1。Duncan多重比较表明，当光照为250mmol·m^-2·s^-1，波吉卵囊藻对氨氮的吸收率高于其他实验组。

图2 不同光照下波吉卵囊藻对氨氮的平均吸收率

Fig 2 Uptake rate of ammonia nitrogen by Oocystis borgei at different light intensity

注：柱形图中具有相同字母者表示在0. 01水平上差异不显著，否则为差异显著。

2.3 藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响也极显著（P<0.01）（图3，表3），随着藻浓度的升高，藻对氨氮的吸收率也随之升高，当藻浓度为5.5×10⁵cells/ml时，吸收速率为最大值1.482μgN·g^-1·h^-1。Duncan多重比较表明，藻浓度为5.5×10⁵cells/ml，波吉卵囊藻对氨氮的吸收率高于其他实验组

图3 不同藻浓度下波吉卵囊藻对氨氮的平均吸收率

Fig 3 Uptake rate of ammonia nitrogen by Oocystis borgei at different algal concentration

注：柱形图中具有相同字母者表示在0. 01水平上差异不显著，否则为差异显著。

2.4正交实验结果

通过单因素方差分析表3得出，温度、光照和藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率影响极显著（P<0.01），而盐度和pH影响不显著（P>0.01）。因此，在本实验各因子设定的水平梯度范围内，温度、光照、藻浓度是影响波吉卵囊藻氨氮吸收率的主要因子，盐度和pH是次要因子。五个因子对波吉卵囊藻氨氮吸收率影响的大小顺序为：藻浓度>光照>温度>pH>盐度。单因素均值统计波吉卵囊藻氨氮吸收率的最优组合为：温度20℃，光照250μmol·m^-2·s^-1，盐度15，pH8.5，藻浓度5.5×10⁵cells/ml（表4）。

表2正交实验L₂₅(5⁵)实验结果

Table 2 Result of orthogonal design test

表3  SPSS单因素方差分析表

Table 3 Oneway analysis of variance of SPSS

表4 各因素均值表

Table 4 The average of various factors

3讨论

3.1温度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

温度是影响微藻生长和繁殖的重要环境因子之一。研究表明，藻类的代谢活动强度与温度呈现这样的关系：即在一定的温度范围内，藻类的吸收速率随着温度的升高而升高，然后随着温度的进一步升高，吸收速率随之下降^[11,12]。有研究表明，温度主要影响藻细胞酶的活性。温度升高，藻细胞酶活性增强，代谢速率加快，所需消耗的营养物质增多，从而促进藻细胞对营养物质的吸收；而温度过高，引起细胞内酶活性降低甚至失活，不利于藻对营养物的吸收，最终导致对营养物的吸收速率下降^[13]。本实验中，温度为20℃～30℃时，波吉卵囊藻对氨氮均有较大的吸收率，而温度低于20℃或高于30℃时，吸收率都明显降低。这与前人的研究结果一致。说明波吉卵囊藻是一种在亚热带地区具较强氮转化能力的微藻，这生物学特性表明了该藻用于对虾池塘水质净化具有较大优势。

3.2 光照对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

     光照是藻类进行光合作用的重要能源，能影响藻类叶绿素a的合成，藻类酶的活性也受到光照强度变化的影响。有研究表明，光照是影响藻类生长和N、P营养盐吸收的重要因子^[14]。光照强度主要通过光合磷酸化调控ATP的转换而影响N的吸收速率^[15]。当温度和营养不限制藻类的生长时，在一定范围内，随光照强度增加总光合作用速率呈直线上升，微藻对氮的利用速率也会随之上升，而光照强度太低或太高也会不利于藻类生长及对营养盐的吸收利用^[16]。本实验研究发现，光照对波吉卵囊藻氨氮吸收率影响极显著，是波吉卵囊藻氨氮吸收率的主要影响因子。随着光照的增加波吉卵囊藻对氨氮的吸收率也随之增大，这与大多数研究者的结果一致^[17,18]。实验光照为250μmol·m^-2·s^-1时，波吉卵囊藻对氨氮的吸收率明显高于其他光照组。由此可知，在光照强度相对较高的亚热带地区，波吉卵囊藻可有效的吸收水体中的氨氮。

3.3 藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收率的影响

有研究指出，藻浓度在比较低的范围内，微藻对营养物质的吸收率随着藻浓度的增加而上升，而当藻细胞的量达到一定的浓度时，其消耗营养物质的量与水中能够提供的量刚好处于短期的平衡，藻对营养物质的吸收率也会达到饱和状态^[19]。张继平^[20]等研究表明，当亚硝酸盐氮浓度一定时，接种小球藻的浓度为2.0×10⁴cells/ml对水体中的亚硝酸盐氮有较高的降解效果，接种浓度超过2.0×10⁴cells/ml时，其降解效果增加并不明显。孙勉英^[21]利用扁藻降低氨氮的实验得出，扁藻浓度的变化是影响实验水体氨氮变化量的最主要因子，当扁藻密度为2.0×10⁴cells/ml时对水体中的氨氮具有较高的吸收速率。本实验结果显示：在设定的藻浓度范围内，波吉卵囊藻对氨氮的吸收率随着藻浓度的升高而明显升高。这与前人的研究结果一致。由于藻类在吸收培育水体中氨氮的同时，也会排泄出其体内的代谢废物，这将对培育水体产生一定的影响。因此，作者认为，在水体中接种适宜浓度的微藻，在提高对氨氮的吸收率的同时又不会对水体造成二次污染。

3.4 波吉卵囊藻对氨氮的去除

微藻具有生长繁殖迅速、对养殖环境适应力强、容易培养等优点，不仅能释放氧气，也能净化污水和保持良好的水环境条件^[19]。不同单胞藻吸收氮源的形式存在一定差异^[7,22]。不少研究资料显示，大部分浮游植物主要以NH⁺₄-N作为主要的氮源^[6,7,21]。微藻的生长和对营养盐的吸收往往受到多种因子的共同调控^[23,24]。本文通过正交实验得出温度、光照、藻浓度是影响波吉卵囊藻氨氮吸收率的最主要的因子，盐度和pH为次要因子。因此，可以通过调控温度、光照和藻浓度来提高藻对水体中氨氮的去除效果。而在水体中添加波吉卵囊藻是一种既简便又行之有效的方法，通过控制藻体浓度，提高藻对水体中氨氮的去除效率，净化水质，从而达到对虾健康养殖的目的。

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